Za pomocą tej techniki można wykryć dowolną sekwencję materiału genetycznego i skutecznie ją powielić. Aktualnie na rynku znajduje się kilka zestawów do testów PCR zawierających specyficzne dla tego wirusa startery, które od razu przyłączają się do wirusowego RNA. Startery te są tak skomponowane, aby były charakterystyczne tylko dla SARS-CoV-2, przez co proces jest znacznie szybszy i dający wiarygodne wyniki. W mieszaninie reakcyjnej znajdują się także specjalne barwniki fluorescencyjne (sondy), które przyłączone do powielanego fragmentu świecą, wzbudzone światłem laserowym. Detekcja świecenia i analiza jego intensywności prowadzi do wnioskowania o ilości powielonego materiału w próbce. Jeśli w badanym materiale nie ma materiału genetycznego wirusa, startery nie przyłączą się do matrycy i nie powielą żadnego odcinka. Jeśli natomiast w próbce znajduje się RNA wirusowe, nawet w śladowej ilości zostanie ono powielone wielokrotnie i wykryte przez urządzenie, a jego ilość określona.

Skąd jednak wiemy, że fragment RNA pochodzi właśnie od koronawirusa SARS-CoV-2? Odpowiedzi udzielił na swoim blogu Virology Down Under australijski mikrobiolog Ian Mackay z Uniwersytetu w Queensland.

Testy typu RT-PCR stosowane do badania wirusa poszukują jedynie niewielkiej części pełnej sekwencji genomu. Ma to sprawić, że testy będą działać tak szybko (godzinę lub mniej) i sprawnie, jak to możliwe.

Metoda PCR “real-time” jest szeroko stosowana od czasu pandemii grypy H1N1 z 2009 roku. Najlepiej sprawdza się ona w przypadku krótszych obszarów docelowych. Metoda RT-PCR w czasie rzeczywistym (RT-rPCR) zawiera produkującą fluorescencyjną sondę DNA. Sonda ta dodaje do testu kolejną warstwę docelowej swoistości. Generuje ona również sygnał, gdy obecne jest wirusowe RNA (gdy go nie ma, nie generuje go). Sonda nie bierze udziału w procesie amplifikacji PCR – po prostu wiąże się z DNA w miarę jego gromadzenia się… w czasie rzeczywistym! Kiedy ilość DNA jest wystarczająca, sonda będzie wytwarzać wykrywalny sygnał fluorescencyjny. Sygnał ten rośnie nieco bardziej w trakcie każdego cyklu, aż do zakończenia PCR.

Ta mała sekwencja zazwyczaj – choć nie zawsze – jest wybierana bezpośrednio pod kątem celu; zarówno startery, jak i sonda wiążą się tylko z zamierzonym celem wirusowym.

PCR czerpie swoją niezwykłą specyficzność ze starterów. Na każdej pozycji nowego startera DNA mamy do wyboru jeden z czterech nukleotydów: dATP, dCTP, dGTP i dTTP. Jeżeli zaprojektowaliśmy specyficzny dla danej sekwencji starter o długości nukleotydów, prawdopodobieństwo, że ta sama dokładna sekwencja wystąpi w sposób losowy, byłoby następujące: (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4) x (1/4). Oznacza to, że istnieje szansa jak 1 do biliona na w 100 procentach identyczną sekwencję występującą w sposób losowy. Raczej małe szanse. Ten ostatni fragment jest istotny z punktu widzenia tego, jak bardzo specyficzne mogą być testy RT-PCR.

(…)

Stosowane obecnie testy RT-PCR są niezwykle skuteczne przy bardzo czułym i konkretnym wykrywaniu SARS-CoV-2, wirusa powodującego COVID-19. Niektóre działają lepiej od innych, ale wszystkie potrafią bardzo dobrze wykryć SARS-CoV-2. Niektóre wczesne testy RT-rPCR zostały zaprojektowane z myślą o ewentualnej zmianie sekwencji w razie, gdyby wirus ulegał wielu mutacjom (ale tego nie zrobił).

Dodatkowo, testy na SARS-CoV-2 nie wykrywają innych koronawirusów, rinowirusów, adenowirusów, wirusów paragrypowych, wirusów grypy, syncytialnych wirusów oddechowych itd., które można znaleźć w tej samej próbce pacjenta.

Sprawdzamy to również w świecie rzeczywistym. Testujemy inne pokrewne i niepowiązane ze sobą wirusy (jak wymienione wyżej) oraz różne rodzaje próbek ludzkich (smarki, ślina, plwocina, wymazy, płyny itp.) podczas procesu zwanego walidacją. W ten sposób wiemy, co mogą zrobić startery – a tym samym test RT-PCR – a czego nie mogą zrobić. To wszystko jest częścią doświadczenia wypracowanego przez dziesięciolecia stosowania przez nas metod PCR.

Oczywiście źle zaprojektowany test RT-PCR może mieć problemy, podobnie jak wszystko w nauce i życiu. Fałszywe wyniki pozytywne i negatywne mogą się zdarzyć z powodu problemów z projektowaniem testów (nie tylko z powodu problemów z pobieraniem próbek i czasem), ale profesjonalne laboratoria czuwają nad tym, minimalizują ryzyko i mogą je zidentyfikować i skorygować. Spędzają czas na projektowaniu testów, ich optymalizacji i walidacji.

Specjalistycznie zaprojektowane i stosowane testy SARS-CoV-2 zostały dobrze sprawdzone pod kątem wykrywania tego wirusa. Wiodące testy zostały również przetestowane na RNA z SARS-CoV-2 oczyszczonego, wyizolowanego i wyhodowanego w komórkach w laboratorium – wiemy więc, że to właśnie ten wirus wykrywamy. Możemy również zaprojektować i zamówić sekwencje wirusowe w laboratorium i zlecić ich wykonanie komercyjne, zatem znowu wiemy, że testy wykrywają sekwencje wirusowe, których od nich oczekujemy, a nie inne wirusy.

– pisze Mackay.

Kolejną tezą prezentowaną w artykule ma być to, że:

SARS-CoV-2 nie spełnia postulatów Kocha

Fałsz. Czym w ogóle są jednak postulaty Kocha? To sformułowane przez Roberta Kocha cztery twierdzenia dotyczące przyczynowości danej choroby przez określony czynnik zakaźny:

• ten sam organizm musi być obecny w każdym przypadku choroby,
• organizm musi być wyizolowany od chorego gospodarza i wzrastać w czystej hodowli,
• izolat może powodować chorobę po zakażeniu zdrowych, podatnych zwierząt,
• organizm musi być ponownie izolowany od zakażonego zwierzęcia chorego.

Chociaż tezy te są ważne również z punktu widzenia współczesnej epidemiologii, nie znajdują one zastosowania we wszystkich przypadkach. Jak zauważa na swoim blogu profesor Vincent Racaniello, mikrobiolog z Uniwersytetu Columbia, już sam Koch dostrzegał ograniczenia swoich postulatów. Dla przykładu czynnik wywołujący cholerę, a więc bakteria przecinkowca cholery, jest obecny również wśród organizmów zdrowych, co stoi w sprzeczności z postulatem nr 2.

Nie zmienia to jednak faktu, że SARS-CoV-2 spełnia postulaty Kocha. Naukowcy zdołali już wyizolować wirusa od osób zakażonych, rozmnożyli go w warunkach hodowli laboratoryjnej i zainfekowali nim makaki, co wywołało chorobę zbliżoną w swoim przebiegu do COVID-19. Następnie wirus został ponownie wyizolowany od zakażonych już nim zwierząt.

Wysokie wartości Cq sprawiają, że wyniki testu są jeszcze bardziej bezsensowne.

Kolejną tezą prezentowaną w artykule ma by fakt, że „wiele testów PCR ma wartość cykli kwantyfikacji [cykli oznaczania ilościowego]” (cycle quantification – Cq) powyżej 35” (pisownia oryginalna). W rzeczywistości zależy to jednak od jakości przeprowadzanego badania, nie zaś samego testu. Zgodnie z wytycznymi zamieszczonymi w instrukcji Zestawu genesig® real-time PCR do detekcji koronawirusa (COVID-19) firmy Primerdesign przed interpretacją wyników próbek należy zweryfikować prawidłowość przebiegu testu. Jeśli kryteria dotyczące odpowiednich wyników Cq nie są spełnione, należy powtórzyć test (s. 14).

Jak czytamy w rekomendacjach Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny:

Ze względu na wysoką czułość analityczną metody real-time PCR szczególny problem stanowią próbki z wynikiem na granicy czułości analitycznej, tj. gdy powyżej 35 cyklu (CT) uzyskano krzywą sygnału reakcji rtPCR o kształcie „S”. Zgodnie z ogólną zasadą należy wynik badania interpretować zgodnie z zaleceniami producenta zestawu diagnostycznego (dla zestawów ze znakiem IVD). Jednakże w procesie walidacji całego układu diagnostycznego może się okazać, że wskazane przez producenta zestawu kryteria interpretacji wyniku trzeba poddać korekcie w celu uniknięcia wyniku fałszywie dodatniego. Pomocne w tym procesie jest stosowanie kontroli (dodatniej i ujemnej) dostarczonych przez producentów zestawów diagnostycznych i zestawów do izolacji RNA. Zalecany jest także udział w programach zewnętrznej kontroli jakości (EQAs) w przypadku gdy będą dostępne.

Ze względu na różny poziom wiremii (liczba kopii SARS-coV-2 w badanej próbce) w okresie rozwoju zakażenia u różnych osób i w różnym czasie od początku zakażenia, w badaniach laboratoryjnych w kierunku SARS-CoV-2 należy spodziewać się wyników dodatnich na granicy czułości analitycznej. W przypadku, gdy wynik dodatni budzi wątpliwości (wynik słabo dodatni), zgodnie z wytycznymi WHO diagnosta ma prawo wystawić wynik nierozstrzygający i zlecić pobranie do badania kolejnej próbki od pacjenta po 24-48h od momentu pobrania próbki, której wynik dodatni budził wątpliwość. Z reguły po upływie 24-48h poziom wiremii w próbce od pacjenta ulega zmianie – wzrasta lub obniża się tak, iż 2 mieści się w obszarze wyniku pewnego analitycznie tj. pozwala jednoznacznie stwierdzić obecność lub brak obecności materiału genetycznego SARS-CoV-2 w badanej próbce. W przypadku uzyskania wyniku „ujemnego” tj. przy braku wykrycia obecności poszukiwanych markerów genetycznych SARS-CoV-2 należy mieć świadomość, że wynik „ujemny” nie wyklucza zakażenia. Z tego względu, w przypadku gdy pacjent wykazuje objawy typowe dla COVID-19 lub miał udokumentowany bliski kontakt z potwierdzonym przypadkiem COVID-19 wskazane jest wykonanie ponownego badania kolejnej próbki od pacjenta. Alternatywnie można przeprowadzić badanie tej samej próbki innym testem molekularnym jeśli jest dostępny.

Podsumowanie

Analizowany artykuł opublikowany został na portalu, który nie może zostać uznany za wiarygodne źródło informacji. Zawiera on nierzetelne i niezgodne z wiedzą naukową tezy dotyczące testów PCR na obecność koronawirusa SARS-CoV-2.

Technologia ta jest powszechnie wykorzystywana na całym świecie (także w Polsce) do wykrywania koronawirusa, a jej skuteczność została potwierdzona przez Światową Organizację Zdrowia.